豬圓環(huán)病毒 3 型（PCV-3）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：豬圓環(huán)病毒 3 型（PCV-3）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name ：Porcine Circovirus type Ⅲ Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】

豬圓環(huán)病毒（Porcine circoviruses，PCV）是單股環(huán)狀的 DNA 病毒，基因組長度約為 1.7kb 長，是最小的動物 DNA 病毒之一。已經(jīng)確定有兩種類型的 PCV，即圓環(huán)病毒 1 型（PCV1）和圓環(huán)病毒 2 型（PCV2）。2015-2016年間，一種新型的圓環(huán)病毒 3 型病毒首先在美國報道，該病毒基因組長為 2.0kb，其能引起豬的皮炎腎病終合癥、繁殖障礙及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應，對豬場疾病控制十分重要。

本試劑盒適用于檢測肺、淋巴結組織、全血等樣本中的豬圓環(huán)病毒 3 型，用于豬圓環(huán)病毒 3 型感染的輔助診

斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計一對豬圓環(huán)病毒 3 型特異性引物，結合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術對豬圓環(huán)病毒 3 型的核酸進行體外擴增檢測，用于科研實驗中對可疑感染者的病原學檢測。

【試劑組成】

包裝規(guī)格50T/盒

PCV-3 反應液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

PCV-3 陽性質控品50μL ×1 管

陰性質控品250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺的豬，取肺、淋巴結等組織；待檢活豬，用注射器取血 5mL。

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL滅菌離心管中；全血樣本：待血凝固后，取血清 100μL 于滅菌離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按照    試劑說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：

試劑PCV-3 反應液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）20μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃10min否

240 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調節(jié) Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內調節(jié)）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內調節(jié)），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。

6.質控標準

陰性質控品：無明顯擴增曲線且無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果；

7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。