新型鵝細(xì)小病毒（NGPV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：新型鵝細(xì)小病毒（NGPV）核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

Name：Diagnostic Kit for Novel goose parvovirus DNA（Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預(yù)期用途】

新型鵝細(xì)小病毒（Novel goose parvovirus, NGPV）屬細(xì)小病毒科（Parvoviridae）、細(xì)小病毒亞科（Parvovirinae）、依賴病毒屬（Dependovirus）。新型鵝細(xì)小病毒病是由新型鵝細(xì)小病毒（novel goos e parvovirus，NGPV）引起的一種病毒性傳染病，又稱短喙侏儒綜合征（short beak and dwarfism syndrome，SBDS），主要感染櫻桃谷北京鴨、番鴨、半番鴨等。臨床表現(xiàn)為短喙、舌頭外伸、腿骨易折斷、生長發(fā)育受阻、死亡等典型的 SBDS 癥狀， 發(fā)病率高但死亡率低。

本試劑盒適用于檢測水禽類心臟、肝臟、脾臟等組織樣本及糞便樣本中的新型鵝細(xì)小病毒，用于新型鵝細(xì)小病毒感染的輔助診斷，其檢測結(jié)果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計一對新型鵝細(xì)小病毒病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對新型鵝細(xì)小病毒的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

NGPV 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

NGPV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

對于死亡水禽，可直接采集心臟、肝臟、脾臟等組織，于 0℃ ~4℃冷藏保存并立即送檢，采樣過程中樣品不得交叉污染[1]。

對于活水禽，可直接采集糞便。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

死亡水禽，剖檢取心臟、肝臟、脾臟等組織，可單獨使用，也可混合使用。各組織剪碎后研磨成糊狀，按

1:5 加入生理鹽水，將混懸液收集于離心管內(nèi)，-20℃反復(fù)凍融三次，以 6000g 離心 5min，取上清液待檢[1]

活禽，取糞便于 1×PBS 中，混勻后瞬時離心，取上清。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取， 請按照試劑說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿

10 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑NGPV 反應(yīng)液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，DB32/T 1460-2009,鵝細(xì)小病毒的檢測 PCR 方法[S]

[2]遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，《禽病學(xué)》第 14 版（譯），ISBN 978-7-5591-2094-6，中國版本圖書館 CIP 數(shù)據(jù)核字

（2023）第 110085 號