細(xì)胞株和菌株【豬靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞】注意事項：

1.實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進行下一個細(xì)胞株之操作。

2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class II)。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心****，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5. 定期檢測下列項目：5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。5.3. 無菌操作臺內(nèi)之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。

請問工作濃度的胰酶是不是應(yīng)保存在－20度？如果放在4度冰箱可以保存多久呢？是不是幾個小時就會失去活性？

平時放在-20度，分裝在50毫升螺口管，用時拿一管放4度用。

1. 認(rèn)真按照操作規(guī)程進行實驗，一般不大會導(dǎo)致污染，很多情況下是由于所用的試劑或培養(yǎng)基有污染而使實驗失敗，

2. 粉末培養(yǎng)基配制好后(加了血清)，一般在4度盡量不要超過1個月，如在-20度存放時間可長一些，但最好也不要超過3-4個月，可能對于永生化細(xì)胞株來說要求不是太高，但我在過去的4年里一直是作原代細(xì)胞培養(yǎng)的，細(xì)胞嬌弱，經(jīng)驗表明放置時間不宜過長。

3. 關(guān)于實驗用品的清洗與消毒，我的經(jīng)驗是：用過的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上，然后加少許清洗劑，以超聲波洗滌30min左右，(如無超聲波洗滌器可用軟毛刷輕輕刷洗干凈)，撈出晾干，再在鉻酸洗液中浸泡6-18h(或過夜)后，自來水清洗10-15遍，雙蒸水清洗3-4遍，晾干，高壓消毒后即可使用。  

許多塑料制品也可以高壓消毒，例如培養(yǎng)瓶蓋，膠塞，吸頭等。不能用于高壓的一般均已制成一次性作用的商品了，當(dāng)然如果money有限，如進口的培養(yǎng)板、皿等，也可以重復(fù)使用1-2次，我當(dāng)時使用方法是將其wan全清潔后，使用前在紫外燈下敞開照射1-1.5h即可，我做過多次，沒有出現(xiàn)問題。塑料培養(yǎng)瓶由于清洗消毒不便，最好不要重復(fù)使用，如一定要重復(fù)用，可用環(huán)氧乙烷等消毒，(消毒后一定要放置半年以上方可使用)

在光鏡下，上皮細(xì)胞通常呈“鋪路石"樣排布，細(xì)胞之間有拉絲現(xiàn)象（即距離較遠(yuǎn)的細(xì)胞可以通過細(xì)長的觸手相連），細(xì)胞有成片生長的特性。而間質(zhì)細(xì)胞通常呈梭形，沒有有成片生長的特性，細(xì)胞之間的聯(lián)系不緊密。但是細(xì)胞的形態(tài)特征會因為生長條件的改變而改變，如HeLa細(xì)胞是上皮細(xì)胞，但是在酸性培養(yǎng)條件下會變?yōu)樗笮巍?/span>

上皮細(xì)胞之間都有特征性的緊密連接（橋粒）結(jié)構(gòu)，因此可以通過觀察培養(yǎng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)來判斷細(xì)胞的類型，如果有緊密連接，就必然是上皮細(xì)胞。這是一錘定音的證據(jù)。注意不要把細(xì)胞消化下來做電鏡，要用細(xì)胞刮刮下來后做電鏡。 此外每一種上皮細(xì)胞都有其特征的細(xì)胞角蛋白的表達（cytokertin, CK）,可以查一下子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞表達的CK分子，然后進行免疫細(xì)胞化學(xué)的鑒定。

細(xì)胞在偏堿的情況下培養(yǎng)，耐受能力會逐漸下降，可能是產(chǎn)生脫壁現(xiàn)象的原因，后來我重新測了一下培養(yǎng)基，為7.5左右，我用滅菌的HCL調(diào)了一下，培養(yǎng)基顏色變成淡紅透亮，再次培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁比較好了，搏動效果也不錯，因此，我以后每次培養(yǎng)前都要重新調(diào)好PH值，我覺得很多因素是能影響PH值的。

血清質(zhì)量不好，影響了細(xì)胞生長。所以，我認(rèn)為以后養(yǎng)細(xì)胞，用的血清濃度最好是每批次血清都摸一下，不一定要以參考文獻為準(zhǔn)，畢竟國產(chǎn)的血清質(zhì)量差異比較大啊。

細(xì)胞無菌操作是關(guān)鍵，對于配制培養(yǎng)液時，有些人為了讓培養(yǎng)粉充分溶解，攪拌4小時或更長時間。其實這wan全沒有必要，一般培養(yǎng)基的固體組分還是易溶于水的，攪拌的時間長了會增加污染機會，雖然后來濾過除菌了，但細(xì)菌的代謝產(chǎn)物比如脂多糖誰能夠把它濾掉？細(xì)菌的代謝是很快的，甚至在常溫下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的經(jīng)驗就是攪拌30min-60min就把它過濾。

另外關(guān)于培養(yǎng)基的pH問題，一般按照說明書操作，加入所說的NaHCO3量，與預(yù)計的pH不會有什么距離，也就是說基本上不用調(diào)pH，如果相差大，要考慮三蒸水的質(zhì)量是否有所下降，當(dāng)然這時調(diào)pH也是不得已而為之。我配培養(yǎng)基時基本上不調(diào)pH，只是用試紙檢測一下pH，觀察一下培養(yǎng)基的顏色。