偽狂犬病毒通用型（PRV-gH）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

通用名稱：偽狂犬病毒通用型（PRV-gH）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name ：Pseudorabies Virus gH gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又稱豬皰疹病毒Ⅰ型、傳染性延髓麻痹病毒、奇癢癥病毒、奧葉茲基氏病病毒。是引起牛、羊、豬、犬和貓等多種家畜和野生動物發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的皰疹病毒[1]。豬是偽狂犬病的唯-一自然宿主，對其危害大?？芍氯焉锬肛i流產(chǎn)，產(chǎn)死胎及胎兒干尸化。對初生仔豬則引起神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)運動失調(diào)，麻痹，衰竭死亡，病死率 100%。成年豬多呈隱性感染，但可引起呼吸道癥狀[2]。病豬、帶毒豬及帶毒鼠類是本病的主要傳染源，病毒主要從病豬的鼻分泌物、唾液、乳汁和尿中排除，有的帶毒豬可持續(xù)排毒一年。

本試劑盒利用實時熒光 PCR 原理，檢測偽狂犬病毒，對偽狂犬病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的診斷及療效評

估有重要指導意義。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，設計一對偽狂犬病病毒通用型特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對偽狂犬病病毒通用型的 DNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺的豬，取腦、淋巴結(jié)、脾臟、肺臟等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物、唾液、乳汁等，   置于 50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血 5mL。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0. 5g 于研磨器中研磨，加入

1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；分泌物棉拭子直接取 100μL 提??；血液取血清 100μL 提取。

1.2 核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按照    試劑說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，單個測試反應液體系配制如下表：

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21μL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2 結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7. 檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3. 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

6. 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

7. 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1. 所有操作嚴格按照說明書進行；

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；

3. 反應液應避光保存；

4. 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7. 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8. 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1] 婁高明，杜偉賢．偽狂犬病流行概況及豬場防制策略[J]．中國動物檢疫，1999，16（5）：43－45.

[2] 殷震，劉景華．動物病毒學[M]．北京：科學出版社，1997.

[3] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 35911-2018 偽狂犬病病毒熒光 PCR 檢測方法.[S].